Rozeznat mononukleózu na základě samotných příznaků bývá mnohdy velice obtížné. Přeci jen jsou její symptomy velice podobné dalším onemocněním. Nejčastěji se setkáváme s přirovnáním k angíně, s níž sdílí své nejčastější příznaky. Jediným směrodatným ukazatelem obvykle bývá pouze extrémní únava, ve vzácnějších případech může být na patře přítomna tečkovitá vyrážka. Přijde-li k lékaři pacient s rozvinutou žloutenkou, bývá jeho stav nejprve přisuzován spíše hepatitidě typu B. I pod samotným pojmem mononukleóza se defakto skrývají dvě onemocnění. V 90% se opravdu jedná o virus Epstein-Barrové, o zbývající procenta se dělí cytomegalovirus, toxoplazmóza či infekce při oslabeném imunitním systému následkem viru hiv. Při záměně s angínou a podání penicilinu se může na kůži objevit výsev červené vyrážky, tzv. rubeoly.
Aby se vyloučily všechny ostatní možnosti, provádí se pro potvrzení diagnózy odběr krve a výtěr krku. Při mononukleóze je často v krku přidružena ještě další infekce či mikroorganismus, a jelikož se ne vždy musí jednat o poměrně neškodnou angínu, je zjištění původce superinfekce podstatné pro následující léčbu. Virus Epstein-Barrové vyvolává zvýšení počtu bílých krvinek, u kterých je patrný netypický tvar. Tento děj někdy může připomínat zhoubné bujení krevních buněk při leukémii. Zmožení monocytům ukazuje na přítomnost viru, k definitivnímu potvrzení slouží sérologická identifikace protilátek. Dle jejich aktuálních hodnot lze rozlišit, v jaké fázi se onemocnění nachází. Ze vzorku krve jsou vyhotoveny i jaterní testy, při nichž je zjišťována aktivita trojice jaterních enzymů a hladina bilirubinu.